Isabel Estuardo nació en el palacio de Dunfermline, en Fife, el 19 de agosto de 1596, siendo la tercera de los 9 hijos de Jacobo VI de Escocia y I de Inglaterra, y de Ana de Dinamarca.

Al momento de nacer, su padre era solamente el rey de Escocia; algunos años más tarde, cuando él sucede a la reina Isabel I como soberano de Inglaterra y de Irlanda, haciendo de su hija una novia aún más atractiva. Isabel recibió su nombre en honor a la reina inglesa.

Parte del plan de la Conspiración de la Pólvora de 1605 era poner a la pequeña Isabel -de apenas 9 años- en el trono de Inglaterra (y, probablemente, en el de Escocia también) como una monarca católica, después de asesinar a su padre y a la nobleza inglesa protestante. Para el momento en que se desarrollaba el complot, ella permanecía en la abadía de Coombe en Warwickshire, de donde los conspiradores planeaban secuestrarla.

Nacida en la ciudad de Alcalá de Henares, el 17 de diciembre de 1485, siete días antes de Nochebuena. Fue la menor de las hijas del rey Fernando II el Católico y de la reina Isabel I la Católica. Era tataranieta del rey Eduardo III de Inglaterra y prima en cuarto grado tanto del rey Enrique VII y de la reina Isabel de York. La hija de los Reyes Católicos era la que más se parecía a su madre: pelirroja, de ojos claros, decidida e inteligente. Catalina tenía sin duda grandes capacidades intelectuales y morales. Recibió una esmerada educación apegada al catolicismo digna de una futura reina, aprendiendo lenguas romances de la península ibérica, francés, flamenco, inglés y, por supuesto, latín, además de artes como la danza y la música.